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【转载】 《皮肤养生学》（30）—— 第五节 评价防治光敏效果的检测方法

美容---皮肤养生学

 

第五节 评价防治光敏效果的检测方法

 

1、光斑贴试验方法

 

光斑贴试验是诊断光变应性皮炎和评价患者光敏性的重要方法，在临床诊断、治疗方面发挥了重要作用，国际上尚无统一的试验方法(包括变应原、照射光源及剂量、试验步骤等)，因此需要进一步规范化、标准化。

 

1.1变应原

 

目前奥地利、德国、瑞士成立的光斑贴试验组所用的变应原有23个，国际标准的接触变应原有20个，欧洲标准接触变应原有25个，国标中常见致敏物28个。

 

1.2原理

 

在皮肤斑试基础上再光照，若对斑试试验物有光变应性，则光照后可产生皮肤迟发型光变态反应。

 

1.3国标规定的皮肤光斑贴试验方法

 

皮肤光斑贴试验方法及反应程度判定：

 

将可疑光敏物于患者背部同时做三处斑贴试验或使用斑贴试验胶带同时进行几种不同试验物。

 

①.    光源：一般采用高压汞气石英灯或水冷式石英灯，在前臂屈侧或腹部测定最小红斑量（MED）。（能诱发皮肤红斑的最小辐射剂量）

 

②.    24h后去除三处斑贴试验物，其中一处去除后立即用遮光物覆盖，避免任何光线照射，作为对照；第二处用低于MED的亚红斑量照射（主要是UVB）；第三处用经普通窗玻璃滤过的光源照射（主要是UVA，时间为MED的20-30倍）。

 

③.    于照射后24，48，72h分别观察结果，反应程度评定见表

 

皮肤无反应                              （﹣）

皮肤呈淡红斑、无浸润                    （±）

皮肤呈红斑、浸润、丘疹                  （+）

皮肤呈红斑、水肿、丘疹、小水疱          （++）

皮肤在红斑、水肿上出现大水疱            （+++）

 

④.    结果判定：未经光照处出现阳性反应者可参照进行诊断；仅在亚红斑量照射处出现阳性反应可判定为光毒性反应；仅在窗玻璃滤过的光源照射处出现阳性反应可判定为光变应性反应；若后两者均出现阳性反应则说明既有光毒反应又有光变应性反应。

 

2、药物的吸光曲线

 

任何光敏反应的发生都以吸收光子能量为前提，如果药物在紫外线和可见光波段没有吸收峰，一般不必进行光敏检测。

 

3、组氨酸光氧化反应

 

3.1原理

 

组氨酸和光敏药物混合后经够剂量的UV照射，组氨酸的咪唑环可能分解，经Pauly反应可用分光光度计检测出剩余组氨酸的含量，通过组氨酸氧化分解的程度反应光敏反应的强度。

 

Pauly反应即组氨酸和重氮苯磺酸（氨基苯磺酸的重氮盐）反应产生红色。

 

3.2试验方法

 

①.        组氨酸吸光度标准曲线

 

②.        组氨酸光氧化试验：500ul不同浓度药品磷酸缓冲盐溶液与组氨酸缓冲液混匀，UVA照射一定剂量后取出，室温下置于暗处30分钟，取样200ul,加磷酸盐缓冲液至2ml，经过Pauly反应后检测剩余组氨酸浓度，用经过不同剂量UVA照射后的药品溶液调零，以抵消经UVA照射后可能引起的药品颜色改变。实验中以磷酸盐缓冲液代替药物作为对照，同时各浓度药品均设立暗室对照。

 

4、光溶血反应

 

4.1原理

 

以红细胞为底物的光毒性模型。药物与红细胞混合后用UV照射，分光光度计检测上清液里的血红蛋白，通过计算溶血率来表示光敏反应的程度。

 

4.2方法

 

①.        血液处理：取新鲜抗凝血，去血浆，用生理盐水洗涤3 次，洗涤后的红细胞用巴比妥缓冲盐水(pH7.4) 稀释成20% 的红细胞悬液。

 

②.        实验方法：在血清稀释板各孔中加入50ul 20% 的红细胞悬液，然后加供试药物1ml，对照以缓冲液代替同时做两块实验板，一块至暗室中静置，另一块置UVA 光源下照射，当照射功率固定不变，以不同的照射时间和不同的药物浓度分别观察药物对红细胞的致溶血反应。实验完毕后，分别取出经照射与未照射的红细胞与药物的混合液，4000r/min 离心10 分钟，取出上清液加5mlSDS 应用液(平时SDS以6%溶于PBS液中，于4℃冰箱保存，用时稀释100倍)，于732 型分光光度计540nm处比色。

 

③.        100%溶血值：取50ul20% 的红细胞悬液，加1ml 巴比妥缓冲盐水，再加5ml SDS 应用液，测吸光度(A)。

 

④.        溶血率的计算：当溶血率>5%以上为有意义。

 

⑤.        溶血率(%)=（照射后样品-未照射样品-无红细胞样品）/(100%溶血值-未照射样品)×100

 

5、3T3成纤维细胞中性红摄取试验

 

5.1原理

 

培养成纤维细胞，培养基内掺入光敏物和中性红，观察光敏物在紫外线作用下抑制细胞摄取中性红的能力，计算紫外线照射后细胞存活率。

 

5.2方法

 

3T3细胞培养于96孔板24小时后，将8个剂量的化学物质处理细胞，1小时后将之暴露于UVA（1.67mW/cm2）下，另有一平行板置于黑暗中，50分钟后，洗去化学物，孵育24小时后换中性红培养基培养3小时，洗去培养基，在540nm处酶标仪测定中性红（NRU）的吸光度值。

 

6、其它方法

 

常见的检测光敏反应的还有光敏性酵母生长抑制试验、淋巴细胞有丝分裂抑制试验、光动力学DNA断裂活性试验、体外皮肤类似物模型等。

 

 

 

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